综述:变温动物的适应性免疫

Abstract适应性免疫系统起源于5亿年前的变温(冷血)脊椎动物。传统上,适应性免疫系统是由表达重组激活基因(Rag)依赖抗原受体的淋巴细胞和MHC组成的。这些特征存在于所有下颌骨的脊椎动物中,包括软骨和硬骨鱼、两栖动物和爬行动物,可能也存在于最古老的下颚脊椎动物,即灭绝的胎盘皮动物中。然而,随着无颌鱼类适应性免疫系统的发现,基于一组完全不同的抗原受体-可变淋巴细胞受体-t和b细胞的分叉,也许是先天样淋巴细胞,可以追溯到所有脊椎动物的起源。本综述探讨比较免疫学的最新进展,促进我们对适应性免疫系统的起源和功能的理解。

Introduction大多数定义了免疫学领域的研究都是在哺乳动物身上进行的,特别是在老鼠和人类身上,而我们的大部分规律和范式都是从这些模型中衍生出来的。然而,Janeway and Matzinger制定了一条新的法则,它说明适应性免疫的行为不是由外来,而是通过模式识别受体(PRRs)被外部或内部危险所激发的,它起源于果蝇黑腹鼠Toll-like receptors的研究。此外,50多年前,在鸟类法氏囊的研究中发现了两个主要淋巴细胞亚群(B细胞和T细胞)的差异。为了了解适应性免疫的起源,我们必须了解变温脊椎动物,以及脊椎动物的直接祖先—较低等的后口动物。在过去的十年里,突破性的发现带来了人们对适应性免疫起源的越来越多的认识,并提醒我们注意新的可能性。

了解免疫进化的一个方便的方法是将免疫系统划分为随着时间的推移而保守的部分,而不是那些变化迅速的部分,这是Jan Klein最初提出的想法。某些免疫特征,如免疫球蛋白M(IgM)的结构和功能,以及胸腺、脾脏、常规αβT细胞受体(TCRs)和MHCⅡ类分子的存在,将在本综述中较为详细地描述,在几乎所有的有颚类脊椎动物(gnathostomes)中都是高度保守的。相反,其他免疫成分,如IgD、γδTCR、自然杀伤受体(NKRs)和非经典的MHC分子都是可塑性的,在基因数目,结构域和功能上总是存在差异。记住这一标准为理解免疫系统的基础提供了一个框架:保留经过验证的事实,但允许进化上的快速变化与其他互补特征,以对抗不断变化的病原体(环境)。

在研究任何系统的进化时,人们都会合理地假设,两个不同物种之间的共同特征很可能存在于它们的共同祖先中。然而,一些类似的特征可能是通过趋同进化得到的;例如,在无颚和有颚类脊椎动物中出现了两组不同的抗原受体,以及鲨鱼和骆驼中的单域免疫球蛋白可变区(V)区域的出现。我们也必须认识到,这是一个常见的严重错误,在图中绘制代表性物种的速记方式并不意味着从较老的分类群衍生出来的物种是最近共同祖先衍生物种的祖先(Fig 1)。也就是说,两个远亲(甚至近亲)生物的共同祖先几乎肯定与任何一个后代都有很大的不同。最后,某一系统的某些特性可能会在某些群体中消失,这是许多已被研究过的硬骨鱼的情况,在所有脊椎动物类中也是如此。然而,记住所有这些进化属性,,在所谓的进化‘大爆炸’中,我们理所当然地认为显著的适应性免疫特征是早期的有颚类脊椎动物(gnathostomes)在相当短的一段时间内产生的,最有可能出现在灭绝的盾皮鱼类(placoderms)(Fig 2)。

无颌鱼有T-like细胞(αβ-like and γδ-like)和B细胞,以及胸腺类似物,MHC被证明是难以找到的(Fig 1、2)。就像可变淋巴细胞受体(VLRs),MHC可能是通过收敛演化在这个群体中产生的。每一组中粘膜适应性免疫是存在的和独特的,如两栖动物和硬骨鱼的研究(和哺乳动物)。在亚分类群中发现软骨鱼、硬骨鱼和两栖动物显示出区别整个脊椎动物门的特征但也(在某些情况下)有着独特的特征(Fig 1)。免疫系统在不同的类群中有着独特的特征,在硬骨鱼类中非常突出,如MHCⅡ类系统的缺失和某些免疫球蛋白亚型的缺失,这与脊椎动物的快速进化相一致。软骨鱼具有独特的免疫球蛋白组织,使得抗原受体基因的出现具有新的功能。虽然NK细胞明显存在于变温动物,由于免疫系统的快速发展,识别NKRs变得非常困难。然而,与MHC相关的NKR基因已在所有脊椎动物中发现,显示出MHC Ⅰ和NKRs早期相关性。在迄今研究的所有鱼类和两栖动物的MHC中都发现了编码MHCⅠ类分子、免疫蛋白酶体和与抗原加工分子相关的转运体(TAP)基因的古老谱系,但是在哺乳动物中,这个原型已经被一个在MHCⅠ类肽特异性中不那么严格的系统所取代。进化上的一大飞跃在两栖动物中是明显的,它们表现出典型的抗体类转换,并且有一个IgG类(称为IgY),它参与典型的记忆免疫反应(Fig 2)。脊椎动物进化的最后一个重大进展是淋巴结的出现和哺乳动物生发中心的形成;变温脊椎动物允许在滤泡树突状细胞(FDCs)出现之前进行免疫研究,而树突状细胞是哺乳动物affinity成熟的主要细胞。本综述将深入研究适应性免疫的所有这些特性,重点讨论引起所有免疫学家兴趣的基本问题,并探讨我们在未来十年中能够和应该解决的问题。值得注意的是,温血性是在低等脊椎动物的几个分类群中发现的,但总的来说,它们的适应性免疫还没有被检测。在这里,我将集中于鱼类、两栖类和爬行动物方面的大部分研究。

Fig 1.

Fig 2.

Evolution of antigen receptors

颚口类的抗体和TCRs是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员,来源于未知的前体。提出了一个通用模型,并在下面讨论。相比之下,无颌鱼VLRs属于古老的富含亮氨酸的重复序列(LRR)受体家族,可能起源于(也是最相关的一种受体)血小板上表达的一种细胞表面受体。在淋巴细胞发育过程中,两种抗原受体都可以产生很高水平的多样性,但用于产生多样性的基因重排机制则完全不同。

Variable lymphocyte receptors

之前对体液免疫和细胞免疫进行的一些研究表明,无颚类具有适应性免疫,对不同的外来抗原和同种抗原有特异性的应答。然而,30多年来对抗体、TCRs和MHC分子的广泛研究被证明是徒劳的,大多数比较免疫学家都认为,尽管早期进行了功能研究,但无颚类没有适应性免疫系统存在。这一假设被Pancer和Cooper证明是不正确的,他们检查了免疫了的七鳃鳗中淋巴细胞的转录组,并发现了大量含有不同数量内部重复序列的LRR蛋白(Fig 3)。这些含LRR的受体在淋巴细胞个体发生过程中被克隆表达并通过重排产生,并被命名为VLRs。第一个要研究的基因是VLRB,该基因在一组七鳃鳗淋巴细胞中表达。VLRB蛋白被糖基磷脂酰肌醇锚定在七鳃鳗刚形成的淋巴细胞表面,然后(通过未知的机制)在抗原刺激后以二聚体的五聚体形式分泌(Fig 3)。首先,人们认为刺激七鳃鳗淋巴细胞类似于哺乳动物的非T细胞依赖的免疫反应,即淋巴细胞上抗原受体的交联,很可能通过PRR与另一个信号结合在一起,可能激活B细胞以诱导VLRB分泌。然而,令人惊讶的是,后来发现VLR基因位点第二次重排,VLRA基因位点由另一部分淋巴细胞表达,其转录组与有颚类T细胞相似。进一步分析发现,第三种抗原受体VLRC主要在上皮和粘膜中表达,因此无颚类T细胞似乎被分裂成两个亚群,可能类似有颚类γδ 和 αβ细胞。

Fig 3.

IgM antibodies

在所有的有颚类中发现多种抗体亚型。多年来,尽管在每个脊椎动物类中IgM有其独特而耐人寻味的特征,IgM一直被认为是原始抗体类。在哺乳动物中,IgM是一种与连接(J)链相关的五聚体。软骨鱼中的IgM有两种形式:就像所有其他脊椎动物一样,存在的一种多重形式,以及一种单体形式,在鲨鱼抗原特异性反应中最常见,很可能是以T细胞依赖的方式产生的(请注意,虽然在所有其他脊椎动物中也发现了单聚IGM,但只有在软骨鱼中才发现它在免疫应答过程中具有重要的生理相关性)。硬骨鱼类IgM的分泌形式是一种四聚体,而j链基因在这一组中已经丢失,因为它存在于古老的软骨鱼中。有趣的是,硬骨鱼分泌的IgM中的二硫键的范围是在抗原特异性反应的过程中修改的,这种亲和力的成熟似乎是这类抗体所独有的。此外,硬骨鱼IgM的跨膜形式也是交替拼接的,因此由于未知的功能原因,它只有三个保守(C)结构域(而不是通常的四个)。总之,IgM是硬骨鱼类中发现的主要血清抗体,是这些动物对常规抗原的反应;软骨鱼除了在适应性反应中使用IgM作为先天抗体类外,还在适应性免疫中使用其他抗体亚型;两栖类IgM(据我们所知)的功能与其哺乳动物的同源基因非常相似。

IgD and IgW antibodies

IgD,长期以来被认为是脊椎动物中新发现的一种,实际上非常古老,它可以追溯到有颚类的起源,一种在软骨鱼中发现的同种异型,叫做IgW(Fig 3)。一种类似于IgD的免疫球蛋白在硬骨鱼类中首先被发现,1998年之前,IgD只在一些哺乳动物中被发现,这是非常令人惊讶的。随后,在两栖动物属非洲爪蟾(Xenopus)基因组数据库中发现了IgD基因,并与哺乳动物一样,通过IgM和IgD mRNA在新生B细胞中的选择性剪接来表达。IgD、IgW在软骨鱼类的同源性也在肺鱼(lungfish)中发现,并且在腔棘鱼(coelacanths)中,它似乎是主要的同工型,这种著名的物种已经失去了IgM。最近有关硬骨鱼类和人类的数据表明,IgD参与炎症反应,与嗜碱性细胞上一个未知的Fc受体结合。与IgM相比,IgD在结构和功能上都有很大的可塑性;IgM在整个进化过程中是非常相似的,而IgD在C结构域的数目上(甚至在IgD本身的存在下)是高度可变的,在功能上可能与跨膜(大部分未知)和分泌(固有细胞武装)的形式有关。

IgG and IgY antibodies

哺乳动物IgG在两栖动物中以一种叫做IgY的同工型出现。IgY与免疫球蛋白类型转换(CSR)同时出现。和IgM一样,IgY重链有四个C域。哺乳动物IgG和IgE均与IgY共同祖先有关,IgE H链维持4个C结构域,而IgG H链失去CH2结构域。在非洲爪蟾中,向IgY的转换及其表达完全依赖于T细胞,而哺乳动物所定义的典型B细胞记忆生成则出现在这一群体中。跨膜IgY和IgG的胞质尾都有一个新的信号基序,它有助于b细胞在记忆反应中的增殖爆发。除了T细胞依赖性外,对哺乳动物外IgY类转换(见下文)的条件知之甚少。在热带非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)基因组中发现了一种与IgY相关但缺乏两个C-terminal结构域的同工型,称为IgF,其功能尚不清楚。

Other antibody isotypes and light chains

在不同的脊椎动物类群中还出现了其他的“dead end”H链免疫球蛋白亚型,最近对它进行了较详细的综述,其功能尚未得到探索。粘膜同工型,如哺乳动物的经典IgA,描述如下。

与多年来的想法不同,轻链(L)分歧为κ 和 λ可追溯到有颚类的起源。在大多数的变温动物中,有第三条原始性L链,σ,它在爬行动物中丢失。在某些分类群中存在着L链亚基,它们也是像H链一样的dead ends,特别是在鱼类中。在所有软骨鱼中,λ基因是‘种系连接’,这使得我们能够很好地分析鲨鱼体内所有互补决定区(CDRs)的体细胞高突变(SHM)。在所有脊椎动物中,对某些H链异构体的L链偏好已被注意到,这是多重L链的一个潜在目的。另一种方法是,有人提出当与类似的H链配对时,不同的L链异构体可能允许不同的CDR构象。最后,如果L链提供了自激活受体,或者第一条L链基因重排是非生产性的,多重L链允许在H链正常工作的细胞中进行受体编辑。

αβ T cell receptors

一般来说,αβtcrs在进化过程中是非常保守的(Fig 1,2)。在技术上可行的情况下,胚胎或新生儿胸腺切除实验表明,适应性免疫依赖于T细胞,包括高密度抗体、抗体转换以及对同种异体移植和病毒感染的细胞免疫。在已研究的所有动物中,TCR多样性相当高,除了在类似自然杀伤性T(NKT)细胞的研究中(见下文)。在某些硬骨鱼类的测序中,发现大量的αβ TCRs参与了它们对抗原(如病毒)的反应。

γδ T cell receptors

在TCR发现的几年中,人们发现了一种新的重组抗原受体,它没有已知的功能,后来被命名为TCRγ。几年后发现了它的伙伴TCRδ,γδ T细胞成为适应性免疫的牺牲品,直到现在我们才开始在分子水平上掌握它们对抗原的识别,至少对于涉及天然免疫的γδ T细胞来说是如此。在除硬骨鱼(和胎盘哺乳动物)以外的所有变温动物中,都有很大比例的TCRδ基因以免疫球蛋白V区H链(IgVH)作为识别元件(BOX 1)。免疫球蛋白H链(IgH)和TCRδ位点在几种脊椎动物中的连锁提示该基因来源于顺式复制,长期以来人们都认识到TCRVδ 和 IgVH共享属性,特别是大范围的CDR3序列。IgH与TCRδ之间的关系是古老的,通过顺式复制,在几种脊椎动物中一直存在着将IgVH导入TCRδ位点。此外,从附近的免疫球蛋白簇中发现鲨鱼IgM和IgW V片段与TCRδ多样性(D)和J片段的转换是高水平的。这些数据表明,很大比例的γδ T细胞以一种适应性的方式发挥作用,这在哺乳动物的几项研究中得到了证实。目前尚需进一步研究变温动物外胚层中γδ T细胞的适应性反应,这些工作才刚刚开始。这在软骨鱼类中尤其令人感兴趣,因为TCRγ V基因已被明确地证明为高突变,类似于免疫球蛋白基因中检测到的基因。

Generating diversity: AID versus RAG

重组激活基因(RAGs)编码的蛋白质被用来重排有颚类(gnathostomes)的所有抗原受体基因。RAG 1主要负责切割重组信号序列(RSSs),并参与RSS识别,而RAG2则在基因重排过程中引导和配合RAG1。最近,一种包括RSSs(或至少末端倒置重复)、插入位点和基因的转座子编码RAG酶在一种叫做文昌鱼(amphioxus)的较低的子宫内被发现(先于脊椎动物)。基因组中有几个转座子,系统发育分析表明,这些转座子在这个物种和相关物种中仍然很活跃。此外,在几个无脊椎动物物种中还发现了一种称为Transib的转座子,RAG1的催化核心,这表明这种转座子是相当古老的。仍然存在的问题是,RAG2是原始转座子的一部分,还是被招募来协助基因重排的基因组中的一个现有基因?请注意,这些RAGs并不用于无颌类(agnathans)的VLR基因重排(见下文),但如上文所述,在先于脊椎动物祖先的后口动物(deuterostomes)基因组中,已经发现了类似于RAG 1和RAG 2的基因,这些基因的功能(如果有的话)是未知的。

2000年,在小鼠和人类中发现激活诱导的胞苷脱氨酶(AID),是哺乳动物SHM和CSR所需的酶。不久之后,在所有的有颚类中都检测到了AID,并在几个物种中显示出能够在次级淋巴组织中进行突变和表达。SHM和CSR分别需要AID氨基和羧基端,因此硬骨鱼这一明显缺乏CSR的系统发育类群的AID能够体外诱导CSR令人惊讶。一种可能是硬骨鱼丧失了CSR的能力,因为软骨鱼基因的簇型组织,以前被认为不能进行CSR(Fig 1)。确实可以在不同的IgM集群之间以及IgW和IgM集群之间进行CSR。在鲨鱼非编码区没有发现具有重复元件或靶区(r=腺嘌呤或鸟嘌呤,g=鸟嘌呤,y=胞嘧啶或胸腺嘧啶)基序的典型开关盒,因此,切换机制和与典型CSR的关系都是未知的。然而,在最古老的脊椎动物具有典型的适应性免疫预示着一个新的研究领域关于AID 和 CSR,这一发现令人兴奋。

AID是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化肽样(APOBEC)家族的成员之一,第一次被发现是mRNA剪接的修饰剂。后来,其他APOBEC成员被证明参与病毒防御和保护基因组免受逆转录病毒侵袭。APOBEC家族的两个成员在七鳃鳗淋巴细胞中表达,一个在发育中的T细胞(胞苷脱氨酶1(CDA1))中,另一个在B细胞中表达(CDA2),这些酶可能是产生VLR多样性所必需的。VLR基因通过VLR盒的同源性连接在一个称为“copy choice”的过程中组装。显然,出现了两种酶,一种用于T细胞的体细胞重排,另一种用于B细胞的体细胞重排,已经不需要对一种酶复合物进行复杂的调控,而这种复杂的调控是与在有颚类(gnathostome) T细胞和B细胞抗原受体基因上行使功能的RAG蛋白相关的。这些CDA酶在体外已被证明是突变体,CDA 1最近已被融合到一个用于体内诱变和基因敲除的crispr盒中。AID和相关分子的发现预示着适应性免疫、天然免疫和一般细胞内平衡的一次令人兴奋的突破。例如,APOBEC家族也参与了反转录元素的扫描,即基因组的一般保护。这一领域还处于起步阶段,通过比较的方法来确定APOBEC家族蛋白在非典型免疫过程中的作用是很有希望的。

Evolution of the MHC

MHC包括第一类、第二类和第三类区域,首次在软骨鱼中发现。在大多数物种中,经典的mhcⅠ类分子和mhcⅡ类分子的多态性水平很高。此外,非经典的MHCⅠ类基因也存在于所有检测过的有颚类中,通常位于与MHC位点本身不同的区域(见下文)。

MHC class II molecules

MHCⅡ类α和β链基因在几乎所有的有颚类均有发现。通常,有两个或三个同型,具有高度的多态性。与MHCⅠ类亚型相比,哺乳动物MHCⅡ类亚型的进化较慢,在变温动物可检测到MHCⅡ类亚型。DO分子在哺乳动物中是II类蛋白质,其通过DM分子调节肽与MHC II类分子的结合,在任何变温动物中均未发现。事实上,DM基因首先出现在两栖动物身上,在硬骨鱼明显缺乏,而且到目前为止,还没有在软骨鱼中发现过DM基因。研究这些催化剂的缺乏如何影响多肽与MHCⅡ类分子的结合是很有意义的;在两栖动物中MHCⅡ类分子的生物化学方面已经做了大量的工作,但在硬骨或软骨鱼类中所做的工作却很少。然而,在所有变温动物中都发现了不变链(这是MHCⅡ类分子稳定组装所必需的),与相应的MHCⅡ类相关不变链肽(CLIP)和预期的组织分布。

硬骨鱼已经失去了MHCⅡ类系统,这首先出现在鳕鱼(cod)中,后来又出现在其他物种中。人们早就知道,免疫后的鳕鱼无法产生特定的抗体反应,从本质上说,对每种抗原产生相同的IgM抗体。生活方式如何影响MHC II类分子的缺乏已被推测 – 这些动物生活在冷水环境中,也许缺乏病原体压力可能导致‘use it or lose it’的情况。有人推测,鳕鱼中大量的非经典MHCⅠ类分子可能以某种方式弥补了MHCⅡ类分子的缺失(Box1),但其他含有MHCⅡ类分子的物种也扩增了MHCⅠ类基因。

MHC class I molecules

经典的和非经典的MHCⅠ类在所有的冷血的有颚类中都有明显的发现。经典的I类分子被其高水平的多态性,普遍存在的组织表达和定义的肽结合残基所识别,这些残基锁定在结合肽的氨基和羧基末端。与哺乳动物不同的是,抗原处理的tap基因和免疫蛋白酶体(特别是蛋白酶体亚基-β8(PSMβ8))基因与MHC Ia基因密切相关,通常是在家系中(Box 1)。

Fig 4.

 

 

Lymphoid tissues: evolutionary insights

The thymus

胸腺存在于所有的有颚类,通常有典型的皮质和髓质组织。它可以从一个小叶到一个多叶甚至不连续的结构,取决于所观察的物种或发育阶段。此外,蛋白酶体亚基β11(PSMβ11; also known as B5T)和自身免疫调节剂(AIRE)在有颚类家族早期出现,这表明,在哺乳动物和早期下颌脊椎动物中,正向和负向选择是以类似的方式发生的(Fig 1,2)。直到最近,人们还相信胸腺在无颚类中是不存在的,但随着携带VLRA的T细胞的发现,这个问题被重新审视。原位探针δ配体(for the Notch receptor)和叉头盒蛋白N1(FOXN 1),这是一种转录因子,被证明是胸腺发育所必需的,它定义了幼虫咽部的一种结构。与这些上皮细胞相关的是淋巴细胞表达VLRA(and in later studies, VLRC)和APOBEC家族酶CDA1,它们被认为是VLRA和VLRC重排过程中重要的分子。在无颚类中这一结构被命名为胸腺样体,并被认为是胸腺的等价物。到目前为止,在无颚类中还没有发现PSMβ11(实际上没有专门的蛋白酶体成分)或AIRE基因,因此,进一步的研究为将T细胞和B细胞发育为不同的原代淋巴组织提供最初的理论基础。文昌鱼等后口动物鳃区的结构也表达FOXN 1和δ配体,因此,研究它们在淋巴细胞分化中的作用(如果有的话)是很有意义的。

The spleen as the primordial secondary lymphoid organ

只有温血动物才有淋巴结、佩耶氏斑和生发中心,所有这些都依赖于细胞因子淋巴毒素的形成。然而,大多数的有颚类,在脾脏中确实会产生适应性的免疫反应,将抗原集中用于抗原特异性T细胞、B细胞和抗原提呈细胞(APCs)之间的相互作用。以软骨鱼类为代表,脾脏可分为红髓和白髓,许多脊椎动物的B细胞也可分为分隔区(请注意,这种隔离结构已经在几个硬骨鱼和两栖动物失去了)。在发育过程中,B细胞被趋化因子CXC-趋化因子配体13(CXCL 13)所吸引,该配体由脾脏血管表达,形成新生的白髓。在哺乳动物中(可能还有爬行动物),B细胞移位至滤泡,T细胞包围小动脉周围的淋巴管鞘。在两栖动物和鱼类中,B细胞保持这种胚胎特征(BOX 1)。有趣的是,在演化过程中,B细胞在T细胞区形成之前形成了分隔结构,这在经典评论文章中有广泛的讨论。

Fig 5.

When did conventional and follicular dendritic cells emerge?

 

 

Mucosal immunity

 

 

T helper cell subsets

哺乳动物T辅助细胞表型分类在过去10年中从经典的Th1和Th2细胞范式扩展到包括Th17细胞、T滤泡辅助细胞(Tfh)、调节t细胞(Treg)和其他几个t细胞亚群。虽然还需要做大量的工作来研究T细胞在变温动物中的功能,但很可能在所有有颚类中都会发现这样的表型(Fig 2)。

 

Innate-like lymphocytes

目前最令人兴奋的免疫学研究领域之一是对先天样淋巴细胞的研究,如NKT细胞、黏膜相关不变T细胞(MAIT)、B1细胞、边缘区B细胞和先天淋巴样细胞(ILCs),包括NK细胞。对它们的进化的研究应该是一个新的优先事项,因为它诱人地提出,ILCs(特别是)可能早于携带抗原受体的淋巴细胞出现。

大多数免疫学家认为先天T细胞(NKT细胞和MAIT细胞)是哺乳动物进化后期的补充,类似于生发中心(Box 2)。当Robert和他的同事在两栖动物属非洲爪蟾中检测到NKT样细胞时,这种想法就被搁置了,这些细胞是XNC中的一个非经典MHCⅠ类分子所特有的。与哺乳动物NKT细胞一样,蛙NKT细胞具有不变性的TCRα链,并具有效应细胞表型。非洲蟾蜍属幼虫表达低水平的经典MHCⅠ类分子,初步证据表明,幼虫TCR库主要由带有这些不变体TCRα链的克隆组成。这项对两栖动物的研究,以及爬行动物和鸟类CD1分子的鉴定,改变了NKT的出现模式。不仅NKT细胞在进化早期出现,而且有人提出,淋巴细胞数量较少的动物主要使用能迅速激发的T细胞,即在抗原受体刺激后能迅速进行到效应器功能,而且,并不是所有情况下都使用有利于克隆选择的大型TCR资源。Robert的研究表明,NKT细胞将遍布脊椎动物亚门,因为如上所述,非经典的MHCⅠ类基因谱系存在于所有脊椎动物中。

NK细胞功能已在所有脊椎动物种类中检测到,但很难识别其受体(注意,在1990年代对哺乳动物的研究中也是如此)。由于灵长类动物和啮齿类动物甚至不使用相同的基因家族来编码它们的主要NKRs,所以NKRs的进化速度非常快,这一点多年来一直很清楚。这种快速的进化速率使得在变温动物中很难检测到NKRs。在两栖动物和鱼类中已经检测到NKR样IgSF蛋白的大基因家族,但在大多数情况下,它们在NK细胞识别中的作用本身还没有确定,许多无疑还有其他功能。相反,很明显,鱼类和两栖动物体内有淋巴细胞,如切除胸腺的动物和没有携带任何类型的TCRs的动物,这些细胞仍然能够诱导细胞溶解。未来的挑战将是将这些受体与特定的细胞功能连接起来。

如上文所述,MHC可以同时容纳IgSF和C型凝集素家族的NKRs(Fig 4),根据研究的分类单元而定。鸟类有两种C型凝集素NKRs,它们在MHC中与哺乳动物NKRs有亲缘关系(甚至是同源)。NK细胞p30相关蛋白(NKp30; also known as NCR3)是一种特殊的IgSF成员,可映射到人类的MHC,是有颚类最保守的NKR,也存在于软骨鱼类中。两栖动物在MHC的Ⅲ类区域(称为XMIV)中具有NKp30的直接同源性,而NKp30在MHC之外易位,并在另一个染色体的端粒上扩展。NKp30,B7同系物6(B7H6; also known as NCR3LG1)的配体也存在于软骨鱼中;有趣的是,在NKp30已经丢失的物种中,B7H6也丢失了;相反,当NKp30基因被扩展时,B7H6基因也被扩展。一般来说,除了人类和啮齿目动物以外的物种还没有对ILCs进行任何详细的检查。已经检测到不携带抗原受体的七鳃鳗淋巴细胞,它们是NK细胞和其他ILCs的候选细胞。

Fig 6.

Quo vadis?

在比较免疫学领域必须解决几个主要问题(Box 3),这里已经谈到了这些问题。无颌鱼类适应系统的发现提供了许多有趣的问题包括胸腺的原始作用(被选中或隔离?),淋巴细胞起源(ILCs或抗原受体携带细胞?),IgSF抗原受体的出现(以什么形式出现?),以及原MHC在VLRA(T细胞样)淋巴细胞中的作用(趋同?)。特别是对于后者,对缺乏粘膜次级淋巴组织的动物进行这一系统的研究可能为理解高度复杂的哺乳动物肠相关淋巴组织提供一个有用的框架。APOBEC家族的进化我们刚刚理解点皮毛。毫无疑问,未来对冷血脊椎动物免疫的研究将使我们感到惊讶,更重要的是,我们将继续改变我们对适应性免疫系统的看法。

 

 

Box 1

Unique adaptive immune features in ectotherms

  • 软骨鱼的免疫球蛋白重链(H)和轻链(L)基因存在于“cluster organization”中,变异(V)、多样性(D)、连接(J)和保守(C)元素在每个簇中存在(Fig 3)。尽管如此,每个B细胞都表现出抗原受体排斥,即每个细胞仅表达1条H链。该组织允许不同类型的免疫球蛋白快速进化,包括一种称为免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)的单域V区抗原受体,免疫球蛋白基因与T细胞受体(TCR)基因的密切关联,以及已被“生殖系”连接起来的簇,并被认为在早期的个体遗传学和成年时期具有独特的功能。
  • 硬骨鱼的一个谱系已经失去了MHCⅡ类基因、不变链和CD4分子,也就是说,很明显,T辅助细胞发育所必需的所有成分都丢失了。鳕鱼可能通过表达过多的非经典的MHCⅠ类基因来弥补,可能会选择一个具有多个自然杀伤T(NKT)样细胞的系统。
  • 两栖动物经历了蜕变,在这一转变过程中,适应性免疫发生了广泛的变化。末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)在幼虫中不表达,因此免疫球蛋白和TCRs中的抗原受体连接缺乏N区,因此多样性较低。此外,典型的MHCⅠ类基因表达也较低,而MHCⅡ类基因在蝌蚪(B细胞和抗原提呈细胞)和成体(所有淋巴细胞)中的表达也不同。变态后,第二波淋巴细胞迅速发育,现在有大量互补决定区3(CDR3)多样性。一种有效的假设是,幼虫的体液免疫是由CD4细胞调节的,但免疫球蛋白库的多样性较低;细胞免疫可能是NKT样细胞的结构域。抑制细胞可能在变态时出现,以防止对新出现的成体特异性自身抗原的自身免疫反应。
  • 著名的腔棘鱼基因组序列揭示了免疫球蛋白M(IgM)的丧失,是迄今为止唯一具有这一特征的脊椎动物物种。IgW基因座可能已经取代了IgM的功能,但是功能研究很难进行,因为这些鱼是稀有和/或濒危物种。
  • 南极鱼类免疫球蛋白显示出明显的选择性,特别是在它们的铰链区域,以便在极冷的温度下保持分子的活性。与大多数哺乳动物不同,变温动物具有与经典的MHCⅠ类、与抗原加工相关转运子(TAP)和免疫蛋白酶体基因相关的血统。这些基因又不同于哺乳动物,与MHC II类基因紧密相连。蛋白酶体亚基-β8(PSMβ8),但不包括PSMβ9或PSMβ10,与其在免疫蛋白酶体组织中的关键功能相一致。请注意,PSMβ8 and PSMβ11 (胸腺蛋白酶体的一部分)都是构成PSMβ5的同构体,这再次表明β-蛋白酶体环的这一成员扮演了关键角色。
  • 软骨性鱼类、两栖类和腔棘皮类(以及古老哺乳动物和鸟类)的TCRδ链利用免疫球蛋白H链的V区,其基因位于TCR αδ位点。这种现象最早是在软骨鱼的IgNAR中发现的,不久后在袋类动物和其他物种中被发现为与δ链相关的单个V结构域或VH结构域。与γδ TCR功能的理论一致,这些发现表明许多脊椎动物的γδ T细胞具有适应性功能。
  • 在所有受检的变温动物中,B细胞都能吞噬颗粒和微生物。这一特征也适用于哺乳动物的B1细胞,表明变温动物B细胞和哺乳动物B1细胞之间以及B细胞和髓样细胞之间存在着古老的联系。
  • 两栖动物的数量正在减少,最好的研究发现了先天免疫机制和病原体对它们的抑制作用。然而,一些研究也暗示了适应性免疫机制,特别是MHC多态性,这些机制与乳糜菌的易感性或抗药性有关。
  • 许多鱼类和两栖动物都是多倍体的,适应性免疫基因在进化过程中被迫变成二倍体(尤其是MHCⅠ类和MHCⅡ类基因),这是几十年来一个活跃的研究领域,并在基因组测序时代得到了振兴。
  • 有人提出了一种关于鲑鱼迁移回原孵化地产卵的免疫假说。在紧张的终末迁移过程中,幼稚的淋巴细胞被耗尽,而浆细胞却幸免,很可能产生针对鱼类最初接触的病原体的抗体。

 

 

Box 2

Humoral immunity in the absence of germinal centres

过去50年的研究表明,总的来说,冷血脊椎动物的特异性抗体反应是低亲和力的,随着时间的推移不会成熟至哺乳动物体内的高水平抗体。在分子时代之前,这是由于在非哺乳动物中可能缺乏体细胞高突变。然而,在二十世纪九十年代早期,在软骨鱼类和两栖类免疫球蛋白基因中发现了突变,最显著的是在鲨鱼抗原受体免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)基因中发现了突变。尽管如此,迄今为止,在任何变温动物免疫研究中,亲和力的增加都不超过100倍,尽管它们至少显示出一定程度的选择。正如本文所描述的,至少在两栖动物的分类水平上,滤泡树突状细胞(FDC)并不存在,最近的研究表明,传统的造血源性抗原提呈细胞刺激T细胞和B细胞。因此,FDC的出现为生发中心的发展提供了条件,也为高亲和力成熟的产生提供了选择环境。正如先前关于免疫球蛋白基因和功能进化的综述中所描述的,激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)的发现为淋巴组织的进化提供了一些见解,但随着时间的推移,应更广泛地用于研究淋巴组织中的适应性反应。此外,这种无颚鱼显然没有次级淋巴器官,因此细胞与抗原接触和相互作用的位置尚不清楚;载脂蛋白b mRNA编辑酶、催化多肽样(APOBEC)家族成员参与了多样性的产生和可能的突变。

Box 3

Key questions for evolutionary immunologists

淋巴细胞发育的转录网络是在适应性免疫出现之前建立的。这个系统是依赖于先天淋巴细胞样(ILC)过程,还是经典淋巴细胞首先出现,然后失去抗原受体?注意,适应性细胞因子,包括IL-2、IL-4、IFN-γ等,到目前为止,只在有颚类中发现。

  • 含有免疫球蛋白超家族(IgSF)和亮氨酸丰富重复序列(LRR)结构域的抗原受体是否共存于一个共同的祖先?是什么推动了新系统的出现?最初的免疫球蛋白和T细胞受体功能系统最初是基于载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样蛋白(APOBEC)家族(基于突变的)、然后被基于重组激活基因(Rag)系统(即基于重排)的系统所取代?其他APOBEC家族成员是如何在整个变温动物系中发挥作用的呢?
  • 原MHC基因编码的IgSF家族成员是否与被Rag转座子侵入的前体基因密切相关,成为原始抗原受体?在由MHC基因编码的抗原受体(VJ型)中发现了这种特定类型的IgSF成员的基因,它们是与这一祖先相关的良好候选基因。
  • 体细胞超突变、种类转换重组和T-B细胞协同作用在变温动物生发中心出现之前明显存在。滤泡树突状细胞是如何和为什么在选择高亲和力抗体的过程中被植入这个系统的?传统的树突状细胞真的是“双重任务”向T和B细胞呈递抗原吗?
  • 哺乳动物的B1细胞和所有变温动物常规B细胞均具有吞噬能力。这是否意味着髓系和淋巴系之间存在着古老的联系,这种机制在冷血和温血脊椎动物的生理上有什么用处?
  • 七鳃鳗T细胞是如何识别抗原的?是否有外来抗原的收缩肽识别,还是有一个完全不同的机制?
  • 为什么胸腺会进化?如果无颚类胸腺样体是一种模型,也许有颚类胸腺的出现不是为了胸腺的正向或负向选择,而是为了使发育中的T细胞远离B细胞发育的微环境(就像骨髓)。它(可能)意味着,一旦获得了T细胞发育的隔离环境,就会出现复杂的正负选择机制,这可能与T细胞对肽-MHC复合物的识别有关。
  • 在翻译方面,可变淋巴细胞受体和鲨鱼单抗是诊断和/或治疗性抗体的新平台。无颚类和/或软骨鱼类与人类之间的巨大系统发育距离允许对人类靶标上进化保守的表位产生免疫反应。这些反应物在我们的药库中证明有多大用处?
  • 从技术上讲,用于基因敲除和突变研究的CRISPR技术的出现将使变温模式生物的基本免疫学取得迅速进展。此外,新一代全基因组和转录组的测序以及蛋白质组的快速发展,至少在某些方面可以在许多研究中避免对模型生物体的要求。
  • 对非哺乳脊椎动物的研究是否会提醒整个免疫学领域γδ T细胞的适应性免疫潜力?我们如何设计实验来了解这些细胞如何识别在所有脊椎动物中的天然抗原?
  • 小鼠和人类的黏膜免疫可能是完全不同的。变温动物的研究如何进一步了解粘膜免疫系统中最基本、最保守的成分?
  • 许多年前,抑制细胞暗示出现在两栖动物蜕变期,以抑制对成虫特异性抗原的任何反应。现在的技术可以用许多新的资源重新审视这一提议。
  • 外周来源的调节性T(Treg)细胞真的是作为调节胎盘哺乳动物父系特异性免疫的细胞亚群出现的吗?也就是说,变温脊椎动物(和鸟类)是否只有胸腺来源的Treg细胞?
  • 动物的生活方式在检查适应性免疫时显然很重要。除了鳕鱼和南极鱼外,还有许多其他种类的硬骨鱼和软骨鱼生活在不同的环境中,应该加以研究。
  • 哪一类先出现:MHCⅠ类还是MHCⅡ类?对于MHCⅠ类,经典分子还是非经典分子先出现?MHCⅠ类分子的可塑性表明它们是原始分子,而MHCⅡ类分子的热力学稳定性是它们早出现的证据。类似地,CD4和CD8不是来自最近的共同祖先,所以它们识别MHC分子的共同选择是独立的。哪个是第一位的?

 

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原文:https://www.nature.com/articles/s41577-018-0003-9

综述——鱼类淋巴细胞:在进化上和哺乳动物ILL类似?

Abstract:淋巴细胞是适应性反应的责任者,就像经典描述的那样,但有证据表明,哺乳动物淋巴细胞的亚群可能表现为先天样细胞,快速地参与非自我活动,没有抗原呈递。哺乳动物体内的类淋巴细胞主要是γδt细胞和b1-b细胞,主要在粘膜组织中发挥作用。可能与人类的病理有关,其功能和组织的起源尚不完全清楚。由于鱼类和哺乳动物的免疫系统在形态和免疫生物学上的相似性,以及具有自由生活的幼虫阶段的独特性,可以精确地监测和改造它们的发育,因此提出了一种研究人类免疫的实验模型-硬骨鱼。然而,鱼类淋巴细胞与哺乳动物先天样淋巴细胞之间的同源性是比较免疫学中考虑较少的一个问题。越来越多的实验证据表明,鱼类淋巴细胞在发育、形态和功能特征上可能与哺乳动物的先天性淋巴细胞有共同之处。尽管有这些相似之处,但关于传统鱼类淋巴细胞和哺乳动物先天样淋巴细胞之间可能存在联系的信息仍然缺乏。本文旨在总结和描述鱼类淋巴细胞与哺乳动物先天样淋巴细胞之间的相似性,支持哺乳动物γδt细胞和b1-b细胞可能与鱼类淋巴细胞进化相关的假说。

Introduction:只有2%的后生动物存在具有mhc、rag、记忆的脊椎动物型适应性反应,但是在先天免疫防御保护下无脊椎动物可以活很长时间。事实上,传统上被定义为只依赖先天反应的无脊椎动物可能活几个世纪,并被发现对再感染有反应,这表明先天免疫机制需要更多的研究。从比较免疫学的观点来看,可以推测在脊椎动物进化早期出现的白细胞群继承并保留了一些与抗原识别和清除相关的无脊椎动物特征。在进化过程中,编码免疫活性的基因以“层”的形式向哺乳动物聚集。这一假说认为,进化产生了一种层次性的免疫系统,在这种系统中,后来物种在发育过程中获得了优势地位,从而产生了负责越来越复杂的免疫活性的细胞群体。因为人们普遍认为“个体发育类似于系统发育”,“分层免疫系统”假说可能为了解脊椎动物的细胞功能提供线索,并为更好地理解人类的病理提供知识。

先天免疫反应是对感染和伤害的第一级防护,通过种系编码受体的细胞对非我或损伤快速做出反应。在哺乳动物中,有不同类型的先天免疫细胞,除了巨噬细胞/树突状细胞/中性粒细胞之外,还描述了固有淋巴样细胞(ILC)。根据表达的转录因子,功能特征和表型可以把ILC分为三类。另一组哺乳动物的非常规或先天样淋巴细胞(mILL)根据具有特性和功能,被认为是先天和适应性反应之间的桥梁。mILL亚群可能会再次出现一个“免疫下层”产生遗传而来的天然多反应抗体和典型的细胞因子模式,用来维持肠道稳态、早期对肠道感染的反应、自身免疫性疾病和癌症、快速无准备地对抗感染和损害。该细胞主要被鉴定为γδt细胞和b1-b细胞,主要分布在粘膜组织中,其功能和起源仍有待进一步研究。

值得注意的是,越来越多的证据表明,常规鱼类淋巴细胞显示出与mILL一些相同的发育、形态和功能特征,而且最近这些相似性引起了免疫学家的注意。然而,旨在澄清鱼类淋巴细胞与mILL之间联系的研究还处于刚开始阶段。

本文综述了目前关于鱼类淋巴细胞与mILL之间可能相似的知识,并利用这些知识提出了这样的假设:大多数鱼类淋巴细胞表现为mILL的类亚群体,因此,mILL亚群(γδt细胞,b1-b细胞)可以代表现存的、进化相关的鱼类淋巴细胞的“下层”。

哺乳动物先天样淋巴细胞:

天然免疫活动的重要参与者是哺乳动物的ILC,它来源于一种常见的淋巴前体,在天然免疫和组织重建中发挥着效应和调节作用。ILC表面没有TCR或Ig重排的受体,根据它们产生的细胞因子及其功能所必需的转录因子的模式将其分为三类。ILC1产生干扰素γ并依赖于Tbet,ILC2产生2型细胞因子(IL-5/IL-13),需要GATA 3,ILC3依赖于RORγt并产生IL-17和/或IL-22。自然杀伤细胞(NK)属于先天淋巴细胞,参与快速的先天反应,表面不表达CD3或淋巴细胞受体。然而,除了经典描述淋巴细胞是负责适应性反应的细胞外,最近发现的mIL亚群体在之前研究的先天适应分类中表现为先天免疫细胞。

mILL参与维持肠道内稳态,并参与对肠道感染的早期反应,在自身免疫性疾病与癌症中能够以独立于MHC的方式产生无偏的天然多反应抗体和典型的细胞因子模式对抗非自我。

哺乳动物表现出先天样活性的主要淋巴细胞亚群已被确认为γδt细胞,粘液相关不变T细胞(MAIT),自然杀伤T细胞(NKT),B1-B细胞,脾边缘区B细胞。

先天样T细胞

γδt淋巴细胞为非常规t淋巴细胞,包括血液中的小T细胞亚群和具有典型淋巴细胞形态特征的肠上皮内淋巴细胞(IELs),其表面种系TCR表型为γ+δ+ (mostly displaying repertoires Vδ1/Cγ1 and Vγ9/Vδ2),并表现出对可溶性和颗粒性抗原的强大吞噬能力。关于免疫球蛋白和αβTCR分子,γδTCR在vdj重组产生的cdr3区域中,利用v链基因显示出最高的自发多样性。γδt细胞可以在胸腺外和独立于抗原相遇的情况下发育,并且是适应性和先天样免疫反应的活跃参与者,例如直接杀死受感染的细胞,参与肿瘤免疫监测,产生病原体清除所需的分子,自发细胞毒性,释放免疫调节细胞因子,并且可以被应激诱导的分子(MIC-A/B,ULBPs)激活,产生促炎症细胞因子和溶解酶。总之,有证据表明γδt细胞起着效应和调节的作用,代表了具有先天和适应性免疫功能的进化原始T细胞子集。最近的数据也证实了这些发现,同时也显示了γδT细胞亚群的存在,这些细胞亚群的先天刺激比TCR更重要,如产生IL-17(γδT-17)和IFN-γ(γδT-IFNγ)的T细胞。

最近发现的哺乳动物先天样t淋巴细胞的其他亚群是MAIT和NKT。MAIT是一种固有的t细胞亚群,主要参与粘膜表面的抗菌免疫,主要存在于人而不是小鼠,它们表现为种系系TCRαβ表型(Vα7.2-Jα33/12/20 in humans, Vα19-Jα33 in mice)和可变但受限制的TCRβ链。MAIT在刺激后产生调节性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17,并表达IL-7、IL-12和IL-18受体。

NKT是αβ-和γδ-t细胞的一个亚群体,与NK细胞不同,其特征是CD1d限制和有限的tcr多样性。它们主要存在于非粘膜组织中,参与抗肿瘤活性,有助于b细胞的增殖和抗体的产生。NKT可进一步分为两个不同的亚群,即Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞,它们优先位于肝脏内。Ⅰ型在小鼠上显示半不变TcR (Vα14Jα18/Vβ2, 7, 8),在人身上显示(Vα24Jα18/Vβ11),而Ⅱ型NKT细胞表现出更多样化的TCR序列。

先天样B淋巴细胞

哺乳动物的b淋巴细胞现在被分类为b2,或经典的,b1,或先天的。通过 Cd5在其表面的差异存在定义这两组主要的b淋巴细胞。B1-B细胞进一步细分为B1a (B1),表型CD5+/IgMhigh/IgDlow,和CD5阴性的B-1b。b1-b细胞以不依赖T细胞的方式产生大量天然多反应抗体,是积极吞噬和杀微生物,可能参与自身免疫,在感染期间,它们在肠粘膜中以分泌iga的浆细胞的形式存在。CD5+ B细胞产生的天然多反应抗体是种系细胞编码的抗原识别分子(class IgM, IgA, and IgG3),具有有限的v区基因,在早期宿主防御、自噬/组织重塑和免疫调节、通过补体激活的经典途径识别病原体和激活天然免疫系统等方面发挥着重要作用。b1-b细胞被认为没有记忆能力,在胚胎期时存在于小鼠肝脏,而在长大后则存在于脾脏和腹膜腔,在那里它们经历自我更新,其机制尚不清楚。

b1-b细胞参与先天活动,在体外通过TLRs(从TLR 1到TLR 8)对刺激作出反应,诱导b1-b细胞增殖并分化为免疫球蛋白分泌细胞。此外,b1-b细胞在先天激活后能快速产生大量的免疫调节细胞因子il-10。另一个具有先天活性的b细胞亚群位于脾髓边缘区,参与以不依赖T细胞的方式产生IgM抗体来抵抗血液中的病原体。

特别令人感兴趣的是先天样b细胞的组织定位,它主要在粘膜表面和肠内发挥作用,在这些位置b1-浆细胞产生的IgA可自发存在,并与肠道菌群发生反应。在成年小鼠和人中,肠粘膜也是γδt淋巴细胞最丰富的部位,其次是呼吸上皮(24)和表皮。粘膜组织在可能感染的过程中mILL种系细胞受体可以快速反应,从而提供独立于适应性反应保护,在没有抗原暴露的情况下,例如在新生儿中。

鱼类淋巴细胞

前面对Mill做了简短的概括,在硬骨鱼中似乎与我们所知的传统淋巴细胞的特征非常相似,在数十年的研究中积累的实验数据显示,有表面αβ-和γδ-tcr的t细胞、表达三种免疫球蛋白类型(igm、igt和igd)的b细胞、淋巴细胞亚群以及一整套编码淋巴细胞相关分子的主基因。在体外和体内,鱼类淋巴细胞被证明具有功能活性,并产生和/或受淋巴细胞相关细胞因子家族的影响。

鱼类T细胞的特征

硬骨鱼中存在两类t细胞,在细胞表面显示αβ-和γδ-TcR,与TCR共受体,基因的表达模式明确地表明T细胞亚群的存在就像在哺乳动物中已知的那样。即cytotoxic (CD8), helper (CD4), and regulatory (Treg, Th17)。近年来,鱼类t细胞的免疫生物学已成为研究调控机制、表面标记物的表达和体外/体内研究的重要课题。就目前的工作而言,现有数据表明,t细胞在鱼类中的分布主要分布在肠和鳃粘膜组织中,而t细胞的活动在这些组织中是多种多样的。在肠道内,IEL表现出体外自发的细胞毒活性,增值能力差(未公开出版发行的; 未发表过的),并在没有抗原刺激的情况下并在体内进行破RAG-驱动的在TcRβ-chain/TcRγ-chain连接长度中给定的v/c组合自发体细胞重排。另一方面,来自鳃的t细胞可以在体外增殖对凝集素产生反应,但rag的表达是可以忽略不计的。这些观察表明,硬骨鱼的肠道可能是t细胞产生的场所,而鳃则可能是t细胞更多发挥效应/辅助作用的场所。鱼类肠道可以成为t细胞的主要产生者,这一假说的支持来自于关于鲈鱼免疫系统发育的数据,即在发育中的肠道之前或同时发现第一抗体阳性的t细胞,而不是在胸腺中检测到。然而,确定鱼类t细胞亚群出现的精确时间和组织的确切知识仍然缺乏。最后,鱼类确实有记忆t细胞,这是通过免疫鲤鱼由il-10调制CD8和CD4群体的反应和增殖来识别的。有趣的是,需要注意的是,由于缺乏体细胞重组而设计的变异斑马鱼(rag-1−/−)在细菌再次暴露后仍然能够提供特定的保护。大西洋鳕鱼基因组中缺乏CD4和mhcⅡ,但在对病原体的免疫挑战中受到保护。这些观察表明,需要对鱼类进行进一步的研究,以更好地阐明t细胞的功能特征,如γδT细胞的吞噬能力。

鱼类B细胞的特征

在鱼类体内产生抗原特异性抗体已经有近70年的历史了,研究表明,鱼类的b细胞表达三种重的Ig链,即IgM, IgT/Z和IgD, 分别通过表达μ, τ, and δ来定义的。以及一些Ig轻链(e.g., two in catfish, three in zebrafish, MW 25–28 kDa)。IGM在鱼类中是四聚体(Mw 450 Kda),系统地存在于体液中,它们可能在高浓度时出现在血清中。IgT/IgZ是以单聚形式(Mw 170 Kda)产生的粘膜免疫球蛋白,然而在鳟鱼粘液中观察到一种非共价的聚合IgT结合。IgD已经在分子水平上进行了研究,它是以一种单体的形式表达的,其分子量为150 kda,但对其在鱼类中的生理作用知之甚少。同样地,鱼的b细胞也是许多研究的对象,其结果也被综合评论。关于目前的工作,鱼类b细胞的主要活动可概括如下:(i)在未免疫的鱼的天然血清中IgM的含量高;(ii)二次免疫后IgM亲和力下降;(iii)存在记忆B细胞;(iv)自发吞噬作用;(v)病原体诱导粘膜分泌IgT(IgA的进化同源物);(vi)存在类似小鼠脾b1-b细胞的肾淋巴细胞前体;(vii)腹膜腔中存在增殖性b细胞;可能表达TLRs。有趣的是,在一些鱼类物种中观察到了有关b细胞的耐人寻味的特征,例如,在成功地对病原体进行免疫后,小体缺乏病原体特异性的IgM,以及在一个腔棘鱼中缺乏完整的IgM基因。

哺乳动物先天淋巴细胞和鱼类淋巴细胞之间的相似性

上面主要概括了mILL和鱼类常规淋巴细胞的主要特征,B细胞和T细胞极有可能的相似之处在图一图二中展现出来。要更好地理解脊椎动物间淋巴细胞的进化,一个非常重要的问题是原始组织的定义和发育过程中的组织定位。实验证据表明,鱼肠可能是t细胞的主要淋巴组织,甚至在它们出现在胸腺之前就可以在那里被检测到,在那里可能存在与胸腺t细胞选择不同的t细胞选择。直到哺乳动物之前可能T细胞亚群与胸腺无关的起源似乎是保守的,其中γδt细胞可能来源于人胎肝和妊娠期6至9周的原始肠,这是通过研究δtcr在人类发育过程中的表达而提出的。事实上,γδt细胞在人的肠道发育过程中起着关键的作用,由于早产儿肠屏障不成熟,从而减少了IEL的数量,可能会发展为严重的小肠结肠炎。

肝脏作为淋巴细胞发育位点的重要性来源于哺乳动物B细胞的起源,在那里发现B1a细胞是在小鼠胎肝中发育出来的,它们在脾脏中迁移,而不是在骨髓中迁移。有趣的是,在小鼠脾脏中,一个淋巴细胞亚群显示出与来自成年金鱼和斑马鱼肾的淋巴sp细胞非常相似的流式细胞术形态特征(sp细胞)。

鱼类中b细胞的起源没有明确的定义,在斑马鱼中,基于b细胞受体基因重排胰腺被认为是主要位点,而在鲈鱼肾中,IHC在孵化后55天已经建立了产生IgM的细胞。虽然在所有被调查的鱼类物种中很明显,t细胞的发育先于b细胞的发育,但没有明确说明b细胞起源的主要位置。

另一个相似之处是雌性与发育中的胚胎之间的免疫传递。在鱼类中,在未受精卵和胚胎第一阶段中,IGM分子的存在和IGM基因的表达来判断和观察到母体抗体通过胎盘转移到胎儿的一个可能的前体过程。在哺乳动物中,b1-b细胞已经存在于胚胎外卵黄囊的早期阶段,并在胎儿肝脏中继续发育,在妊娠晚期和婴儿期,IGM占主导地位。

其他实验证据表明,哺乳动物b1-b细胞产生的低亲和力多反应血清天然IGM抗体与鱼类中IGM的存在/反应有显著的相似之处。与哺乳动物和其他被调查的脊椎动物一样,鱼类的一次抗体反应动力学涉及IGM,但与哺乳动物不同的是,在鱼类中既不存在类转换二级反应,也没有明显增加血清Igm亲和力,尽管免疫后可以观察到特异性抗体滴度。值得注意的是,对鱼类抗体反应的保护机制和特异性有待于充分了解,因为一些鱼类在免疫后得到了保护,而没有产生特异性的IGM抗体。此外,IGM甚至可以完全缺失,就像在一个缺乏IGM基因的物种中发现的那样。鱼类中天然IGM作为天然免疫参与者的重要性可能在于它们在血清中的含量,因为未免疫的鱼类(5种血清7.7mg/ml)中IGM的平均浓度远高于人类IGM的平均浓度(1.3 mg/ml)。考虑到鱼类缺乏IgG,较高浓度的天然IGM能以尚未完全了解的方式促进机体对病原体的免疫,因此,研究天然IGM在天然免疫中的作用,以及免疫时b细胞产生特异性IGM的动力学,可以为了解哺乳动物天然抗体的生理提供一些线索。粘膜组织分泌的ig在与外界环境交界处的病原体清除中尤为重要,而硬骨鱼有一个与粘膜相关的IGT类,其特征就像肠道共生微生物的涂层,先于哺乳动物特异性分泌型IgA。虽然IgT与IgA不是同源的,很明显,这两种分子的进化是趋同的,它们都是多聚的,主要产生在粘膜中,并且是由黏膜免疫诱导的。

鱼类白细胞表达TLRs,对LPS有较强的体外反应,TLR 5对鞭毛素有较强的应答作用,TLR 3对病毒poly I:C有较强的应答作用。虽然这些反应已经在白细胞中进行了检测,但是根据从鱼头肾转录组获得的核苷酸序列,推测鱼b细胞应该表达病原体特异性保守的TLRs,鱼b细胞的淋巴组织显示几种TLRs基因表达的存在。鉴于鱼b细胞上存在TLRs,这与哺乳动物b1-b细胞上的TLRs有明显的相似之处。

另一群鱼类IgM-B细胞位于腹腔,能在抗原刺激后迅速增殖,产生多反应抗体,并负责清除病原体。同样,在哺乳动物体内,b1-b细胞在抗原刺激后能迅速增殖,并能迁移到包括肠道在内的外围,以对抗病原体。

总结

脊椎动物的免疫防御系统在其分子和细胞组成中是非常保守的,它来自于硬骨鱼类,这是目前更古老的直接给哺乳动物带来的进化谱系的代表。由于了解脊椎动物的形态和生理过程的相似之处,因此将硬骨鱼作为一种额外的动物模型,用于研究免疫识别的病理和生理学,以将研究成果应用于人类疾病模型的翻译研究为目的,斑马鱼模型可以很容易地做到这一点。因此,硬骨鱼类在了解脊椎动物免疫反应的进化过程中起着重要的作用,而实验证据表明,与疾病有关的哺乳动物先天样淋巴细胞的某些特征,如慢性淋巴细胞白血病和炎症,可以从鱼类淋巴细胞的知识中获益。

本综述中所描述的假设是,较年轻的物种(哺乳动物)保留了祖先(鱼类)的免疫防御特征,而这些祖先因进化而获得了新的细胞和分子基因“层”,在哺乳动物中可能由具有先天活动的细胞组成的“较低”免疫层,其中包括先天样淋巴细胞。

本文所考虑的实验证据表明,鱼类淋巴细胞的形态、基因表达和功能特征与哺乳动物先天样淋巴细胞亚群有相似之处,但在鱼类淋巴细胞的免疫生物学方面,如肠道t细胞/γδt细胞和b1-b细胞的来源/功能等方面仍有许多有待进一步了解的东西。

考虑到MAIT仅限于哺乳动物,因此仍需阐明NKT在鱼类中的可能存在,在鱼类中缺乏对自发细胞毒性细胞进行明确的表面表型鉴定。我们还需要更详细地研究鱼类αβ/γδT细胞的精确时间和组织来源,IgM/IgT B细胞的转录特征,以及天然多特异性IgM的产生和动力学特性以及γδT细胞的吞噬能力等功能活动。

重要的是,哺乳动物先天样淋巴细胞(即γδT cells and B1-B cells)的亚群可能是鱼类淋巴细胞的现存类似物的假说已经被提出,并得到了最近的一份出版物的支持。这些工作表明淋巴细胞的起源,可能包括先天样淋巴细胞,可以追溯到所有脊椎动物的起源。因此,研究鱼类淋巴细胞的发育和免疫生物学在比较免疫学中具有重要的意义。这对于更好地了解哺乳动物先天样淋巴细胞的免疫生物学及其与人类疾病的关系可能很重要。

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原文:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.00971/full

叔本华:作为意志和表象的世界(二)

    那认识一切而不为任何事物所认识的,就是主体。因此,主体就是这世界的支柱,是一切现象,一切客体一贯的,经常作为前提的条件;原来凡是存在着的,就只是对于主体的存在。每人都可发现自己就是这么一个主体,不过只限于它在认识着的时候,而不在它是被认识的客体时。而且人的身体既已是客体,从这观点出发,我们也得称之为表象。身体虽是直接客体,它总是诸多客体中的一客体,并且服从客体的那些规律。同所有直观的客体一样,身体也在一切认识所共有的那些形式中,在时间和空间中;而杂多性就是通过这些形式而来的。但是主体,作为认识着而永不被认识的东西,可就不在这些形式中,反而是这些形式总要以它为前提。所以,对于它,既说不上杂多性,也说不上杂多性的反面:统一性。我们永不能认识它,而它总是那认识着的东西,只要哪儿有“被认识”这回事。

所以,作为表象的世界,也就是这儿我们仅在这一方面考察的世界,它有着本质的、必然的、不可分的两个半面。一个半面是客体,它的形式是空间和时间,杂多性就是通过这些而来的。另一个半面是主体,这却不在空间和时间中,因为主体在任何一个进行表象的生物中都是完整的,未分裂的。所以这些生物中每一单另的一个和客体一道,正和现有的亿万个生物和客体一道一样,都同样完备地构成这作为表象的世界;消失了这单另的一个生物,作为表象的世界也就没有了。因此,这两个半面是不可分的;甚至对于思想,也是如此,因为任何一个半面部只能是由于另一个半面和对于另一个半面而有意义和存在:存则共存,亡则俱亡。双方又互为限界,客体的起处便是主体的止处。这界限是双方共同的,还在下列事实中表示出来,那就是一切客体所具有本质的,从而也是普遍的那些形式,亦即时间、空间和因果性,无庸认识客体本身,单从主体出发也是可以发现的,可以完全认识的;用康德的话说,便是这些形式是先验地在我们意识之中的。康德发现了这一点,是他主要的,也是很大的功绩。我现在进一步主张,根据律就是我们先天意识着的,客体所具一切形式的共同表述,因此,我们纯粹先天知道的一切并不是别的,而正是这一定律的内容。由此产生的结果是:我们所有一切先天明确的“认识”实际上都已在这一定律中说尽了。我在《根据律》那篇论文中已详尽地指出,任何一个可能的客体都服从这一定律,也就是都处在同其他客体的必然关系中,一面是被规定的,一面又是起规定作用的。这种互为规定的范围是如此广泛,以至一切客体全部存在,只要是客体,就都是表象而不是别的,就整个儿都要还原到它们相互之间的必然关系,就只在这种关系中存在,因而完全是相对的。关于这些,随即再详论。我还曾指出,客体既各按其可能性而分为不同的类别,那由根据律普遍表示出的必然关系也相应的出现为不同的形态,从而又反过来保证了那些类别的正确划分。我在这里一贯假定,凡是我在那篇论文中所已说过的都是读者所已熟悉的,并且还在记忆中;因为,如果还有在那儿没有说过的,就会在这里给以必要的地位。

转载:叔本华哲学智慧

ggplot2绘制富集分析柱状图

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pathbar = ggplot(pathway,aes(x=Pathway,y=-1*log10(Pvalue)))
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pathbar + geom_bar(stat="identity") + coord_flip()
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pqbar
pqbar+geom_hline(yintercept=2,color=c("red"),linetype=4)

pie图绘制

x <- c(344,1619,1002,74,882,117,1292,58,68,158,73,303,139,579,92,93,2110,997)
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pie(x, labels = label,radius =1.8,col =c("black","blue","brown","cyan","green","greenyellow","grey","grey60","lightcyan","magenta","midnightblue","pink","purple","red","salmon","tan","turquoise","yellow"),clockwise = TRUE)
percent<-round(100*x/sum(x),2)
percent <-paste(percent, "%", sep = "")
pie(x, labels = percent,radius =1.8,col =c("black","blue","brown","cyan","green","greenyellow","grey","grey60","lightcyan","magenta","midnightblue","pink","purple","red","salmon","tan","turquoise","yellow"),clockwise = TRUE)
pie(x, labels = percent,main="饼图",radius =2.0,col =c("black","blue","brown","cyan","green","greenyellow","grey","grey60","lightcyan","magenta","midnightblue","pink","purple","red","salmon","tan","turquoise","yellow"),clockwise = TRUE)
pie(x, labels = percent,main="饼图",radius =2.0,col =c("black","blue","brown","cyan","green","greenyellow","grey","grey60","lightcyan","magenta","midnightblue","pink","purple","red","salmon","tan","turquoise","yellow"),clockwise = TRUE)
legend(locator(1),label, cex=1.2, fill=c("black","blue","brown","cyan","green","greenyellow","grey","grey60","lightcyan","magenta","midnightblue","pink","purple","red","salmon","tan","turquoise","yellow"))

awk命令将fastq文件转换成fasta

awk '{if(NR%4==1||NR%4==2){print $0}}'  test.fq | sed 's/^@/>/g' > myfile.fasta

 有时候,比如说我们需要做一个clustalw,我们需要将多行的fasta文件(multiple line fasta)格式文件,转换成单行的fasta文件(single line fasta)序列文件,怎么办呢。 巧用awk + printf一行搞定。
awk '/^>/ { print n $0;}  !/^>/ {printf "%s", $0, n="\n"}  END {print ""}'  test.fa

 

WGCNA(my project)

setwd("D:/Ma_transcription/WGCNA/")
database <- read.table(file = "COS_deseq_counts_normalized.txt", sep = "\t", header = T, row.names = 1, stringsAsFactors = F)
library(reshape2)
library('WGCNA')
enableWGCNAThreads()#打开多线程
WGCNA_matrix = t(database[order(apply(database,1,mad), decreasing = T)[1:10000],])
subname=sapply(colnames(database),function(x) strsplit(x,"_")[[1]][1])
datTraits = data.frame(gsm=names(database),
subtype=subname)
rownames(datTraits)=datTraits[,1]
head(datTraits)
# Choose a set of soft-thresholding powers
powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
datExpr <- WGCNA_matrix
# Call the network topology analysis function
sft = pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5)
# Plot the results:
par(mfrow = c(1,2));
cex1 = 0.9;
# Scale-free topology fit index as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
     xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",
     main = paste("Scale independence"));
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
     labels=powers,cex=cex1,col="red");
# this line corresponds to using an R^2 cut-off of h
abline(h=0.90,col="green")
# Mean connectivity as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
     xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n",
     main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red")
sft$powerEstimate
net = blockwiseModules(datExpr, power = sft$powerEstimate,
                       maxBlockSize = 5000,TOMType = "unsigned", 
                       minModuleSize = 30,reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
                       numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
                       saveTOMs = TRUE,
                       saveTOMFileBase = "AS-green-FPKM-TOM",
                       verbose = 3)
table(net$colors)

# Convert labels to colors for plotting
mergedColors = labels2colors(net$colors)
table(mergedColors)
# Plot the dendrogram and the module colors underneath
plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], mergedColors[net$blockGenes[[1]]],
                    "Module colors",
                    dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
                    addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)
## assign all of the gene to their corresponding module 
## hclust for the genes.
#明确样本数和基因数
nGenes = ncol(datExpr)
nSamples = nrow(datExpr)
#首先针对样本做个系统聚类树
datExpr_tree<-hclust(dist(datExpr), method = "average")
par(mar = c(0,5,2,0))
plot(datExpr_tree, main = "Sample clustering", sub="", xlab="", cex.lab = 2, 
     cex.axis = 1, cex.main = 1,cex.lab=1)
## 如果这个时候样本是有性状,或者临床表型的,可以加进去看看是否聚类合理
#针对前面构造的样品矩阵添加对应颜色
sample_colors <- numbers2colors(as.numeric(factor(datTraits$subtype)), 
                                colors = c("grey","blue","red","green"),signed = FALSE)
## 这个给样品添加对应颜色的代码需要自行修改以适应自己的数据分析项目。
#  sample_colors <- numbers2colors( datTraits ,signed = FALSE)
## 如果样品有多种分类情况,而且 datTraits 里面都是分类信息,那么可以直接用上面代码,
##当然,这样给的颜色不明显,意义不大。
#构造10个样品的系统聚类树及性状热图
par(mar = c(1,4,3,1),cex=0.8)
plotDendroAndColors(datExpr_tree, sample_colors,
                    groupLabels = colnames(sample),
                    cex.dendroLabels = 0.8,
                    marAll = c(1, 4, 3, 1),
                    cex.rowText = 0.01,
design=model.matrix(~0+ datTraits$subtype)
colnames(design)=levels(datTraits$subtype)
moduleColors <- labels2colors(net$colors)
# Recalculate MEs with color labels
MEs0 = moduleEigengenes(datExpr, moduleColors)$eigengenes
MEs = orderMEs(MEs0); ##不同颜色的模块的ME值矩阵(样本vs模块)
moduleTraitCor = cor(MEs, design , use = "p");
moduleTraitPvalue = corPvalueStudent(moduleTraitCor, nSamples)

sizeGrWindow(10,6)
# Will display correlations and their p-values
textMatrix = paste(signif(moduleTraitCor, 2), "\n(",
                   signif(moduleTraitPvalue, 1), ")", sep = "");
dim(textMatrix) = dim(moduleTraitCor)
par(mar = c(6, 8.5, 3, 3));
# Display the correlation values within a heatmap plot
labeledHeatmap(Matrix = moduleTraitCor,
               xLabels = names(design),
               yLabels = names(MEs),
               ySymbols = names(MEs),
               colorLabels = FALSE,
               colors = greenWhiteRed(50),
               textMatrix = textMatrix,
               setStdMargins = FALSE,
               cex.text = 0.5,
               zlim = c(-1,1),
               main = paste("Module-trait relationships"))                 main = "Sample dendrogram and trait heatmap")
head(design)
# names (colors) of the modules
modNames = substring(names(MEs), 3)
geneModuleMembership = as.data.frame(cor(datExpr, MEs, use = "p"));
## 算出每个模块跟基因的皮尔森相关系数矩阵
## MEs是每个模块在每个样本里面的值
## datExpr是每个基因在每个样本的表达量
MMPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneModuleMembership), nSamples));
names(geneModuleMembership) = paste("MM", modNames, sep="");
names(MMPvalue) = paste("p.MM", modNames, sep="");
## 只有连续型性状才能只有计算
## 这里把是否属于 CB 表型这个变量用0,1进行数值化。
CB = as.data.frame(design[,2]);
names(CB) = "CB"
geneTraitSignificance = as.data.frame(cor(datExpr, CB, use = "p"));
GSPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneTraitSignificance), nSamples));
names(geneTraitSignificance) = paste("GS.", names(CB), sep="");
names(GSPvalue) = paste("p.GS.", names(CB), sep="")
module = "turquoise"
column = match(module, modNames);
moduleGenes = moduleColors==module;
sizeGrWindow(7, 7);
par(mfrow = c(1,1));
verboseScatterplot(abs(geneModuleMembership[moduleGenes, column]),
                   abs(geneTraitSignificance[moduleGenes, 1]),
                   xlab = paste("Module Membership in", module, "module"),
                   ylab = "Gene significance for CB",
                   main = paste("Module membership vs. gene significance\n"),
                   cex.main = 1.2, cex.lab = 1.2, cex.axis = 1.2, col = module)

#首先针对所有基因画热图
nGenes = ncol(datExpr)
nSamples = nrow(datExpr)
geneTree = net$dendrograms[[1]]; 
#生成全基因不相似TOM矩阵
dissTOM = 1-TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = 6); 
plotTOM = dissTOM^7; 
diag(plotTOM) = NA; 
#TOMplot(plotTOM, geneTree, moduleColors, main = "Network heatmap plot, all genes")

#然后随机选取部分基因作图
nSelect = 400
# For reproducibility, we set the random seed
set.seed(10);
select = sample(nGenes, size = nSelect);
selectTOM = dissTOM[select, select];
# There’s no simple way of restricting a clustering tree to a subset of genes, so we must re-cluster.
selectTree = hclust(as.dist(selectTOM), method = "average")
selectColors = moduleColors[select];
# Open a graphical window
sizeGrWindow(9,9)
# Taking the dissimilarity to a power, say 10, makes the plot more informative by effectively changing
# the color palette; setting the diagonal to NA also improves the clarity of the plot
plotDiss = selectTOM^7;
diag(plotDiss) = NA;
TOMplot(plotDiss, selectTree, selectColors, main = "Network heatmap plot, selected genes")

#最后画模块和性状的关系
# Recalculate module eigengenes
MEs = moduleEigengenes(datExpr, moduleColors)$eigengenes
## 只有连续型性状才能只有计算
## 这里把是否属于 Luminal 表型这个变量用0,1进行数值化。
CB = as.data.frame(design[,2]);
names(CB) = "CB"
# Add the weight to existing module eigengenes
MET = orderMEs(cbind(MEs, CB))
# Plot the relationships among the eigengenes and the trait
sizeGrWindow(5,7.5);
par(cex = 0.9)
plotEigengeneNetworks(MET, "", marDendro = c(0,4,1,2), marHeatmap = c(3,4,1,2), cex.lab = 0.8,                         xLabelsAngle= 90)
# Plot the dendrogram
sizeGrWindow(6,6);
par(cex = 1.0)
## 模块的聚类图
plotEigengeneNetworks(MET, "Eigengene dendrogram", marDendro = c(0,4,2,0),
                      plotHeatmaps = FALSE)
# Plot the heatmap matrix (note: this plot will overwrite the dendrogram plot)
par(cex = 1.0)
## 性状与模块热图
plotEigengeneNetworks(MET, "Eigengene adjacency heatmap", marHeatmap = c(3,4,2,2),
                      plotDendrograms = FALSE, xLabelsAngle = 90)
# Recalculate topological overlap
TOM = TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = 6); 
# Select module
module = "blue";
# Select module probes
probes = colnames(datExpr) ## 我们例子里面的probe就是基因名
inModule = (moduleColors==module);
modProbes = probes[inModule]; 
## 也是提取指定模块的基因名
# Select the corresponding Topological Overlap
modTOM = TOM[inModule, inModule];
dimnames(modTOM) = list(modProbes, modProbes)
nTop = 200;
IMConn = softConnectivity(datExpr[, modProbes]);
top = (rank(-IMConn) <= nTop)
vis = exportNetworkToCytoscape(modTOM[top, top], edgeFile = paste("CytoscapeInput-edges-top200", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""), nodeFile = paste("CytoscapeInput-nodes-top200", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""), weighted = TRUE, threshold = 0);

参考:lncRNA实战项目-第六步-WGCNA相关性分析

 

MA图绘制

# 导入ggplot2包
library(ggplot2)

# 设置好工作目录(到数据所在目录)
# 读取输入数据  "R0-vs-R3.isoforms.filter.tsv"
data = read.table("R0-vs-R3.isoforms.filter.tsv",header=T,row.names=1)

# 计算M值和A值,并将M作为y轴,A作为x轴
aes = aes(x=(log2(R0_fpkm)+log2(R3_fpkm))/2,y=log2(R0_fpkm)-log2(R3_fpkm))

# 绘制MAplot
ggplot(data=data,aes) + geom_point(aes(color=significant))

# 添加辅助线
ggplot(data=data,aes) + geom_hline(yintersect=0,linetype=4,color="blue") + 
geom_point(aes(color=significant))

# 改变点的大小
maplot = ggplot(data=data,aes) + geom_hline(yintersect=0,linetype=4,color="blue") + 
geom_point(aes(color=significant),size=1)

# 设置自定义染色
maplot + scale_color_manual(values=c("green","black","red"))

# 设置标题
maplot + scale_color_manual(values=c("green","black","red")) + 
labs(title="MAplot of R0-vs-R3",x="A",y="M")

# 保存MAplot
ggsave("R0-vs-R3.MAplot.png",width=8,height=6)

DESeq2使用流程

library("DESeq2")
database <- read.table(file = "COS_genes.count_table.xls", sep = "\t", header = T, row.names = 1)
countData <- database[,1:15]
condition <- factor(c(rep("COS0",3),rep("COS1",3),rep("COS3",3),rep("COS6",3),rep("COS12",3)), levels = c("COS0", "COS1","COS3","COS6","COS12"))
countData <- round(as.matrix(countData))
coldata <- data.frame(row.names = colnames(countData), condition)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, DataFrame(condition), design= ~ condition )
dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > 1, ]
dds <- DESeq(dds)
res0vs1 <- results(dds, contrast = c("condition","COS1","COS0"))
table(res0vs1$pvalue <0.001)
res0vs1 <- res0vs1[order(res0vs1$pvalue),]
write.table(as.data.frame(res0vs1), file="res0vs1.xls", sep="\t", quote = F)

PCA图绘制

输入表达矩阵数据文件

library(ggplot2)
library(gmodels)
inname = "COS_deseq_counts_normalized.txt"
outname = "COS_PCA.png"
group <- factor(c(rep("COS0",3),rep("COS1",3),rep("COS3",3),rep("COS6",3),rep("COS12",3)), levels = c("COS0", "COS1","COS3","COS6","COS12"))
## step 1: 数据的读取和处理
# read the expr data
expr <- read.table(inname, header=T, row.names=1)
# transpose the data
data <- t(expr)
## step2:PCA分析
# do PCA 
data.pca <- fast.prcomp(data)
## step3: PCA结果解析
# fetch the proportion of PC1 and PC2
# 一般情况下PC1 + PC2 > 70% 二维PCA散点图才有效
a <- summary(data.pca)
tmp <- a[4]$importance
pro1 <- as.numeric(sprintf("%.3f",tmp[2,1]))*100
pro2 <- as.numeric(sprintf("%.3f",tmp[2,2]))*100

# 将成分矩阵转换为数据框
pc = as.data.frame(a$x)

# 给pc的数据框添加名称列和分组列(用来画图)
pc$group = group
pc$names = rownames(pc)

## step 4: 绘图
# draw PCA plot figure
xlab=paste("PC1(",pro1,"%)",sep="") 
ylab=paste("PC2(",pro2,"%)",sep="")
pca=ggplot(pc,aes(PC1,PC2)) + 
geom_point(size=3,aes(shape=group,color=group)) + 
geom_text(aes(label=names),size=4)+labs(x=xlab,y=ylab,title="PCA") + 
geom_hline(yintercept=0,linetype=4,color="grey") + 
geom_vline(xintercept=0,linetype=4,color="grey") + 
theme_bw()

# 保存结果
ggsave(outname,pca,width=10,height=8)